folder Filed in Генна інженерія
CRISPR: змусити злоякісні клітини знищувати один одного
Oleksandr Petrenko comment 0 Comments

За останні десять років опубліковано більше 11000 робіт за ключовими словами “генна інженерія” і “рак”, в минулі роки особливо перспективними були роботи по імунотерапії раку за допомогою модифікованих Т-лімфоцитів. У липні 2018 року вчені Harvard Medical School в експерименті модифікували злоякісні клітини, щоб вони боролися з іншими клітинами пухлини.

📚Навіщо і що було раніше?
Існують невирішені питання при лікуванні злоякісних пухлин в пізніх стадіях, а також пухлин, чий злоякісний потенціал особливо високий, наприклад, пухлини легенів і меланоми. На жаль, такі види пухлин супроводжуються високою летальністю і терапія пізніх стадій не є ефективною, можуть бути відсутні види лікування з сильним рівнем доказів. Дослідження в області генної інженерії можуть допомогти створити нові види терапії.
Раніше дослідники намагалися використовувати циркулюючі пухлинні клітини для доставки онколітичних вірусів, змусити виробляти молекули, що викликають апоптоз сусідніх пухлинних клітин, впливати на мікрооточення (наприклад, модифікувавши клітини пухлини для експресії TNF, що викликало апоптоз і ушкоджувало ендотелій нових судин). На жаль, через “самотоксичність”, протипухлинна активність знижувалася: клітини самі вмирали від цих модифікацій. А якщо не вмирали, то існував ризик формування ними метастатичних вогнищ.

📖Що вирішили зробити автори?
Дослідивши різні види пухлин на предмет їх рецептор-опосередкованого клітинного сигналінгу, автори прийшли до висновку, що різновид молекули TNF-пов’язаного апоптоз-індукуючого ліганда (S-TRAIL, або ST) – перспективний протипухлинний агент, що викликає апоптоз пухлинних клітин завдяки впливу на рецептори DRs (DR4 і DR5) і не викликає значну токсичність у звичайних клітин. Дослідники перевіряли гіпотезу про ефективність модифікації, яка змушує пухлинні клітини виробляти таку молекулу. При цьому вони постаралися уникнути аутокринной “аутотоксічності” таких клітин і додали можливість “наведення” їх на специфічні пухлинні рецептори.

🐁Детальніше про експеримент
Дослідників цікавили безпека і ефективність при двох підходах:
1. Використовувати чужорідні пухлинні клітини, які були б несприйнятливі до ST (в клінічних умовах був би потрібен підбір по HLA);
2. Використовувати власні пухлинні клітини, за допомогою CRISPR досягти фенотипу, стійкого до терапії ST.
Експеримент проводився на модельних мишах з гліобластомою, які були розподілені по групах в залежності від обсягу пухлини, кінцевою метою було виживання.

🔬In vitro
Щоб перевірити гіпотезу in vitro, дослідники культивували клітини трьох модифікацій пухлин:
1. Клітини гліобластоми, що виробляють ST і не чутливі до нього;
2. Клітини гліобластоми, що виробляють GFP, зелений флуоресцентний білок і не чутливі до ST (контроль);
3. Клітини гліобластоми, що виробляють люціферазу світлячків (Fluc, червоний колір) і чутливі до ST.
Як і очікувалося, останні гинули через вплив молекул ST на “рецептори смерті” (DR), що викликало каспаза-індукований апоптоз значної кількості клітин протягом 72 годин. При цьому аутокринна токсичність була виключена, клітини контрольної групи виживали.

📑Резистивний фенотип
Щоб “терапевтичні” пухлинні клітини не вмирали самі, їх модифікували за допомогою CRISPR-Cas9. Були створені клони з експресією Cas9 та гід-РНК, націленої на гени, що кодують рецептори смерті типу DR4 та/або DR5, внаслідок виник клон клітин з нокаутом, DR-KO, що було підтверджено виявленням мутацій екзонів цих генів при секвенуванні, а при флоуцитометрії виявлено значне зниження поверхневої експресії цих рецепторів. Повністю резистивний фенотип до молекули ST був досягнутий у пухлинних клітин DR4/5 double-KO.

📙Система “суїциду”
Оскільки було відомо, що такі ST-стійкі клітини можуть формувати метастатичні вогнища, дослідники впровадили в них систему “суїциду”, систему HSV-TK (ген тирозинкінази вірусу простого герпесу). При взаємодії з ганцикловіром, такі модифіковані клітини гинуть, що було підтверджено in vitro. В мишах ж було виявлено, що, при призначенні ганцикловіра протягом 10 днів, пухлина-специфічний PET сигнал перестав фіксуватися.

📜Пухлинний “ефект свідка”
Вперше феномен був описаний в 90-х, коли в культурі з >10% клітин, модифікованих HSV-TK, після впливу ганцикловіром вмирали і не модифіковані клітини. Імовірно це відбувається тому, що модифіковані клітини виділяють апоптичні везикули, які фагоцитуються оточуючими пухлинними клітинами і це запускає апоптоз вже всередині них. Автори перевірили цей ефект і це знову спрацювало: in vitro через 24 години кількість немодифікованих клітин стало знижуватися, а через 96 годин вони були практично усунені. Був зроблений висновок, що ST-модифіковані клітини в поєднанні з HSV-TK модифікацією діють ще краще за рахунок “ефекту свідка”.

📘Хіміотерапія
Була підтверджена гіпотеза: ад’ювантна терапія не впливала на чутливість клітин до DR-націленої терапії. Клітини, чутливі до ST, були модифіковані для вироблення люціферази та введені в пухлини мишей з гліобластомою, була проведена терапія темозоломідом (TMZ). Після досягнення ефекту, а потім рецидиву, щурів умертвили та вивчили пухлини. Виявилося, що чутливість до TMZ зменшилася, зате до ST не змінилася або навіть посилилася.

🐭In vivo
Були введені модифіковані клітини такими способами:
1. У резекційну порожнину від TMZ-резистивної пухлини. У мишей, яким введено такі клітини, виживаність була краще, і продовжена ще більше після терапії ганцикловіром;
2. Інтратуморально, в рецидивну пухлину: у порівнянні з контролем виживання в групі з введенням клітин достовірно краще, проте тільки якщо потім застосувати ганцикловир – важливо усунути введені клітини;
3. У сонну артерію мишам, у яких було інтракраніальне метастатичне вогнище від раку молочної залози. У порівнянні з контролем у мишей, яким введено клітини, зростання метастатичної пухлини було меншим і виживаність була значно краще. Спочатку клітини імплантувались на відстані ~1,5 мм. від вогнища, потім починали до нього мігрувати.

👨‍🔬👩‍🔬Які висновки?
По-перше, було підтверджено, що у модифікованих пухлинних клітин є терапевтичний потенціал, в тому числі для лікування пацієнтів з рецидивами і метастатичними пухлинами.
По-друге, дослідникам вдалося уникнути передчасної загибелі “терапевтичних” клітин через аутокринну токсичність, чого не вдавалося в ранніх роботах.
По-третє, запровадивши “систему суїциду”, ризик формування нових вогнищ менший.
Хоча був показаний хороший результат в доклінічних дослідженнях, дослідження з пацієнтами з DR-терапією поки що показують суперечливі результати. Автори сподіваються, що їх дані допоможуть удосконалити методики і домогтися кращих.

_____
Література:
C. Reinshagen, et al. CRISPR-enhanced engineering of therapy-sensitive cancer cells for self-targeting of primary and metastatic tumors. Sci. Transl. Med. 10, eaao3240 (2018).

Freeman SM et al. The “bystander effect”: tumor regression when a fraction of the tumor mass is genetically modified. Cancer Res. 1993 Nov 1;53(21):5274-83.

Facebook Comments

CRISPR-Cas9 DRs HSV-TK S-TRAIL TMZ TNF